Nietypowy wariant choroby Fabryego u mężczyzn z hipertrofią lewej komory ad

Próbki utrwalono w 10% formalinie i zatopiono w parafinie. Skrawki cięto i barwiono hematoksyliną i eozyną do analizy mikroskopowej światłem. W przypadku mikroskopii elektronowej próbki zanurzono w utrwalaczu zawierającym 3% aldehydu glutarowego i 2% paraformaldehydu buforowanego 0,1 M buforem fosforanowym (pH 7,4). Następnie utrwalono je za pomocą tetratlenku osmu, odwodniono w stopniowanej serii kąpieli etanolowych i osadzono w żywicy epoksydowej. Odcinki ultracienki pocięto, podwójnie wybarwiono octanem uranu i cytrynianem ołowiu i zbadano pod mikroskopem elektronowym (model H-7100, Hitachi, Tokio, Japonia). Próbki krwi traktowane heparyną otrzymano od siedmiu pacjentów, którym podano diagnozę choroby Fabry ego po uzyskaniu świadomej zgody. Genomowy DNA wyizolowano z pełnej krwi za pomocą zestawu WB ekstraktora DNA (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japonia) zgodnie z instrukcjami producenta. Linie komórkowe limfoblastów ustalono dla sześciu z siedmiu pacjentów (pacjenci od 2 do 7), przy użyciu wirusa Epsteina-Barr.24 Linie komórkowe utrzymywano w pożywce RPMI-1640 uzupełnionej 10% surowicą płodową i 1% penicyliną. -Streptomycyna (GIBCO, Grand Island, NY) w 37 ° C w 5% dwutlenku węgla. Nie można ustalić linii komórek limfoblastycznych dla Pacjenta 1. Całkowity RNA został przygotowany z hodowanych limfoblastów metodą ekstrakcji kwas tiocyjanian-fenol-chloroform guanidium.25 Poli (A) + RNA oczyszczono za pomocą chromatografii kolumnowej oligodeoksytymidyna-celuloza.25
Analizę hybrydyzacji Northern przeprowadzono z użyciem poli (A) + RNA jako próbki zgodnie ze standardową metodą. Poli (A) + RNA rozdzielano elektroforetycznie w żelu formaldehydowo-agarozowym, przenoszono przez przepłukanie kapilarne do membrany nylonowej (Hybond-N, Amersham, Buckinghamshire, Wielka Brytania) i hybrydyzowano z sondą DNA (cDNA) pełnej .-galaktozydazy, znakowaną [.-32P] trifosforanem deoksycytydyny zgodnie ze standardowymi technikami. 26 Po autoradiografii filtr przemyto 0,1% sodu siarczan dodecylu w wodzie w temperaturze 95 ° C przez 10 minut, a drugą hybrydyzację przeprowadzono z cDNA znakowanym trifosforanem [.-32P] deoksycytydyny w postaci .-aktyny jako kontrolą.
Cztery biotynylowane sensowne startery oligonukleotydowe i cztery antysensowne startery oligonukleotydowe zastosowano do amplifikacji eksonów od do 7,27. Reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) zastosowano do amplifikacji genomowego DNA od każdego z siedmiu pacjentów z chorobą Fabry ego z odpowiednimi zestawami starterów. Dwuniciowe produkty PCR denaturowano, a biotynylowane pojedyncze nici izolowano przez wychwytywanie powinowactwa za pomocą powlekanych streptawidyną kulek magnetycznych (Dynabeads M-280, Dynal, Norwegia). Biotynylowane jednoniciowe produkty PCR poddano następnie sekwencjonowaniu z terminacją łańcucha dideoksy za pomocą starterów do sekwencjonowania specyficznych dla .-galaktozydazy.27
Badanie przejściowej ekspresji .-galaktozydazy przeprowadzono za pomocą komórek COS-1. 28 Transfekowaliśmy komórki COS-1 w 60-mm płytkach do hodowli tkankowej za pomocą 20 .g plazmidowego DNA na płytkę, która zawierała normalną lub zmutowaną .-galaktozydazę. cDNA, stosując technikę szoku fosforanowo-glicerynowego.29 Transfekowane komórki inkubowano w pożywce Ham F10 uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą, zebraną w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem po 72 godzinach i stosowano do testu a-galaktozydazy i immunoblottingu.
[przypisy: gefitynib, olx nekla, scyntygrafia dynamiczna nerek ]